@MASTERSTHESIS{ 2011:940036653,
 	title = {Análise da expressão da β-Xilosidade II da bactéria aquática
 Caulobacter crescentus e seu papel no aproveitamento de
 resíduos agroindustriais.},
 	year = {2011},
 	url = "http://tede.unioeste.br:8080/tede/handle/tede/2821",
 	abstract = "Materiais lignocelulósicos são abundantes em resíduos agroindustriais e subprodutos da
 agroindústria e podem ser usados para produção de combustíveis e outros químicos de
 interesse comercial. Uma alternativa aos métodos físicos e químicos para bioconversão de
 material lignocelulósico é o uso de enzimas produzidas por micro-organismos. A bactéria
 aquática Gram negativa Caulobacter crescentus apresenta potencial biotecnológico para o
 uso destes resíduos por conter em seu genoma vários genes que codificam para enzimas
 envolvidas com o metabolismo de materiais lignocelulósicos, incluindo 5 genes para β-
 Xilosidases. No presente trabalho o gene xynB2 (1,5 kb), que codifica para a β-xilosidade II
 de C. crescentus, foi clonado no vetor pJet1.2 (Fermentas) e subclonado em fase de leitura
 nos sítios EcoRI/XbaI do vetor de expressão pPROEX-HTa (Invitrogen). Uma proteína de
 fusão com cauda de histidinas foi obtida após indução da expressão do gene xynB2 em E.
 coli (DH10B) com IPTG (1mM). A β-xilosidade II recombinante (β-Xil-II-rec) foi purificada por
 cromatografia usando resina de níquel-sepharose e a enzima pura caracterizada quanto a
 parâmetros cinéticos e bioquímicos. Uma banda única de 65 KDa foi obtida em gel SDSPAGE
 9% para a β-Xil-rec-II purificada de C. crescentus, a qual mostrou uma atividade
 específica de 215 U/mg, pH ótimo igual a 6, temperatura ótima de 55°C e meia vida de 4
 horas a 50°C. Após 24 h de incubação em pH 6 a enzima reteve 95% da atividade inicial. A
 maioria dos íons inibiu a atividade de β-xilosidade II, mas um aumento de 32% foi observado
 na presença de KCl (2mM). Os parâmetros cinéticos KM e VMáx foram iguais a 8,4 mM e 370
 moles/min, respectivamente. A capacidade da β-Xilosidase II recombinante pura de C.
 crescentus hidrolisar xilano e o resíduo bagaço de cana foi avaliada após incubação prévia
 destes com a Xilanase purificada de Aspergillus alliaceus. As porcentagens relativas de
 produtos de hidrólise do xilano e bagaço de cana-de-açúcar aumentaram 2,5 e 6,5 vezes,
 respectivamente, após incubação por 18 horas com a β-Xil-II-rec pura de C. crescentus,
 ressaltando assim, a possibilidade de aplicação desta enzima em processos
 biotecnológicos. Em adição, a β-Xil-II-rec foi usada para a produção de um anticorpo
 policlonal em coelho que mostrou por ensaios de  Western Blot  uma elevada especificidade
 para reconhecimento da proteína purificada. Paralelamente, com o objetivo de investigar o
 papel do gene xynB2 para C. crescentus, dois mutantes foram obtidos. O primeiro foi
 construído pela inserção de um cassete de resistência a espectinomicina dentro do gene
 xynB2 por dupla recombinação homóloga, gerando uma linhagem mutante nula denominada
 RSJU-2. Os segundo foi obtido por clonagem do gene xynB2 sob o controle de um promotor
 indutível por xilose gerando uma linhagem denominada pMOA. A atividade de β-Xilosidase
 foi mensurada nas células das linhagens RSJU-2, pMOA e parental (NA1000) de C.
 crescentus, as quais cresceram na ausência e presença de diferentes resíduos
 agroindustriais. A depleção do gene xynB2 fez as células mais hábeis a produzirem altas
 atividades de outras β-Xilosidases na presença de diferentes resíduos ou fontes de carbono.
 Estes resultados indicam que a ausência do gene xynB2 regula positivamente a expressão
 de outras β-Xilosidases em C. crescentus. Por outro lado, um decréscimo na atividade de β-
 Xilosidases foi observado na linhagem pMOA, sugerindo que a superexpressão da β-
 XilosidaseII regula negativamente a atividade de β-Xilosidases. Para verificar se a variação
 nos níveis de atividade de β-Xilosidase ocorre como um reflexo de variações nos níveis de
 transcrição de genes de β-Xilosidases nas diferentes cepas, foi construído uma fusão de
 transcrição a partir da clonagem do promotor do gene xynB2 a frente do gene lacZ de E.
 coli. Assim, foi quantificada a atividade de β-Galactosidase como uma medida da atividade
 do promotor do gene xynB2, o que demonstrou que gene xynB2 é dependente de
 transcrição.",
 	publisher = {Universidade Estadual do Oeste do Parana},
 	scholl = {Programa de Pós-Graduação "Stricto Sensu" em Engenharia Agrícola},
 	note = {Engenharia}
}