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Tipo do documento: Dissertação
Title: Deleção parcial do fator de transcrição ACE1 para otimização da produção de celulases por trichoderma reesei RUT-C30
Other Titles: partial deletion of ACE1 transcription factor for optimization Trichoderma reesei RUT-C30 cellulase production
Autor: Dudek, Débora Nakadomari 
Primeiro orientador: Maller, Alexandre
Primeiro membro da banca: Maller, Alexandre
Segundo membro da banca: Silva, José Luís da Conceição
Terceiro membro da banca: Maller, Ana Cláudia Paiva Alegre
Resumo: O bioetanol de segunda geração emprega materiais lignocelulósicos na sua elaboração. Uma das etapas para a degradação destes materiais utiliza celulases produzidas por microrganismos. Dentre estes, o fungo Trichoderma reesei é um dos principais produtores de celulases utilizadas na indústria. A modificação genética deste fungo pode levar à otimização da produção de suas enzimas, diminuindo o custo e melhorando a fabricação de biocombustíveis. Desta forma, o objetivo do trabalho foi deletar a região dos motivos dedos de zinco no gene que codifica o fator de transcrição repressor de celulase ACE1 do fungo T. reesei RUT-C30, buscando a otimização na produção enzimática. Na construção dos primers para amplificação das regiões 5’ e 3’ de ace1 e do marcador de seleção hph, que confere resistência à higromicina B, utilizou-se o site Joint Genome Institute – JGI e o programa BioEdit®. A construção do cassete de deleção com o vetor pRS426 foi mediado pela levedura Saccharomyces cerevisiae SC9721. Posteriormente, a construção do cassete, a transformação de T. reesei RUT-C30 foi realizada através de protoplasto e a confirmação desta transformação foi efetuada por amplificação de parte do hph utilizando os primers hphNestF e hphNestR. Após a transformação, com os mutantes obtidos, a atividade de endoglucanase, exoglucanase e celulase total foi quantificada com os substratos carboximetilcelulose (CMC), celulose microcristalina (Avicel®) e papel de filtro Whatman (PF), respectivamente. A produção enzimática e a eficiência na hidrólise da biomassa foram realizadas comparando-se a linhagem RUT-C30 aos mutantes. Após a construção do cassete de deleção, a amplificação de um fragmento de 3501 pb confirmou a formação do cassete. E, posteriormente à transformação da linhagem RUT-C30, o amplificado de 989 pb foi observado, confirmando a deleção da sequência alvo em 3 mutantes. Com o ensaio de atividade de celulases, as 3 linhagens transformadas mostraram maior produção enzimática quando comparadas à linhagem RUT-C30. Nessa comparação, foi observada diferença estatística significativa da linhagem RUT-C30Δace1-1 com Avicel® e PF (p<0,001), da linhagem RUTC30Δace1- 2 com CMC (p<0,01) e PF (p<0,05) e da linhagem RUT-C30Δace1-3 com Avicel (p<0,001), CMC e PF (p<0,01). Os mutantes também apresentaram maior eficiência na hidrólise da biomassa, com aumento na liberação de açúcar entre 21 e 42%. Com base nos dados deste estudo, os mutantes apresentam-se promissores para a produção mais eficiente e viável de etanol. Apesar disso, testes adicionais devem ser realizados para melhor entendimento da aplicabilidade destes fungos a nível industrial.
Abstract: Second generation bioethanol employs lignocellulosic materials in its preparation. One of the steps for these materials degradation utilizes cellulases produced by microorganisms. Among these, Trichoderma reesei fungus is one of the main cellulases producers used in industry. This fungus genetic modification can lead to enzimes production optimization, reducing cost and improving biofuels manufacture. Thus, the present work objective was delete the sequence encoding zinc fingers motifs of cellulase ACE1repressor transcription factor from T. reesei RUT-C30 fungus, seeking enzymatic production optimization. In primers construction for amplification ACE1 regions 5’ and 3' and the hph selection marker, which confers hygromycin B resistance, Joint Genome Institute - JGI site and the BioEdit ® program were used. The deletion cassette with pRS426 vector construction was mediated by Saccharomyces cerevisiae SC9721 yeast. After the cassette construction, T. reesei RUT-C30 transformation was made by protoplast and this transformation confirmation was effected by part of the hph using hphNestF and hphNestR amplification primers. After transformation with mutants obtained, endoglucanase, exoglucanase and total cellulase activity was quantified with carboxymethylcellulose substrates (CMC), microcrystalline cellulose (Avicel®) and Whatman paper filter (PF), respectively. The enzymatic production and biomass hydrolysis efficiency were performed comparing RUT-C30 strain for mutants. After deletion cassette construction, a 3501 bp fragment amplification confirmed the cassette formation. Posteriorly, RUT-C30 strain transformation, a 989 bp amplification was observed, confirming the 3 mutants target sequence deletion. With cellulase activity assay, 3 transformed strain showed higher enzymatic production when compared to RUT-C30 strain. In this comparison, a significant statistical difference was observed of RUT-C30Δace1-1 strain with Avicel® and PF (p <0.001) CMC (p <0.01), RUT-C30Δace1-2 strain with CMC (p<0,01) e PF (p<0,05), and RUT-C30Δace1-3 strain with Avicel (p<0,001), CMC and PF (p<0,01). The mutants also showed greater efficiency in biomass hydrolysis, with release sugar increase between 21 and 42%. Based on this study, mutants are promising for most efficient and viable ethanol production. Nevertheless, additional tests must be carried out to better understand these fungi applicability in the industrial level.
Keywords: Fungo
Cassete de deleção
Transformação
Material lignocelulósico
Bioetanol
Fungus
Deletion cassette
Transformation
Lignocellulosic material
Bioethanol
CNPq areas: CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIA
Idioma: por
País: Brasil
Publisher: Universidade Estadual do Oeste do Paraná
Sigla da instituição: UNIOESTE
Departamento: Centro de Ciências Médicas e Farmacêuticas
Program: Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Campun: Cascavel
Citation: DUDEK, Débora Nakadomari. Deleção parcial do fator de transcrição ACE1 para otimização da produção de celulases por trichoderma reesei RUT-C30. 2017. 56 f. Dissertação ( Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, 2017.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
Endereço da licença: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
URI: http://tede.unioeste.br/handle/tede/2954
Issue Date: 7-Feb-2017
Appears in Collections:Mestrado em Ciências Farmacêuticas (CVL)

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