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Tipo do documento: Dissertação
Title: Produção, purificação e caracterização parcial da invertase obtida por fermentação em estado sólido de soja com Aspergillus casiellus
Other Titles: Production, purification and partial characterization of invertase obtained from solid state cultivation of Aspergillus casiellus on soybean substrate
Autor: Novaki, Lexandra 
Primeiro orientador: Hasan, Salah Din Mahmud
Primeiro coorientador: Kadowaki, Marina Kimiko
Primeiro membro da banca: Peralta, Rosane Marina
Segundo membro da banca: Klen, Márcia Regina Fagundes
Resumo: A invertase, enzima encontrada em leveduras, sobretudo na espécie Sacharomyces cerevisiae, invertebrados, vertebrados, algas verdes, bactérias, vegetais e fungos, é uma das principais responsáveis pela hidrólise da sacarose para a formação de açúcar invertido e é utilizada por indústrias alimentícias e farmacêuticas, na hidrólise da rafinose, inulina e gentianose. No presente trabalho objetivou-se a purificação e caracterização parcial da invertase, obtida por fermentação em estado sólido. A invertase foi produzida por Aspergillus casiellus utilizando como substrato farelo de soja por um período de 72 a 220h, a 25 ºC. A extração das enzimas foi feita utilizando shaker a 120 rpm por um período de 1h. O extrato obtido foi filtrado e estocado em freezer. A recuperação da enzima invertase foi feita através de precipitação das proteínas com solventes orgânicos, sulfato de amônio e através de choque térmico. A purificação da invertase foi conduzida em coluna de DEAE-celulose. Foram caracterizados atividade enzimática do material fermentado, a estabilidade quanto à temperatura e ao pH, temperatura e pH ótimos, efeito da presença de íons, quelantes, agentes redutores e detergentes, além da determinação de carboidratos neutros e especificidade ao substrato. A atividade específica do extrato bruto foi de 1029,75 após um período de 72h de fermentação usando o farelo de soja como substrato. A recuperação por precipitação por sulfato de amônio e solventes foi menos eficiente que um choque térmico para a recuperação da invertase do extrato bruto. A enzima foi parcialmente purificada através de precipitação por choque térmico (utilizando sobrenadante) e cromatografia de troca aniônica em DEAE-celulose com um fator de purificação de 30,30 vezes e rendimento de 42,70%. As análises eletroforéticas estimaram a massa molecular da invertase estudada em torno de 25,5 kDa. Após ser submetida às etapas de purificação, a enzima manteve as condições ótimas de pH 4,0 e de temperatura 70 ºC. Após 24 horas de incubação em pH 4,0, a invertase homogênea manteve 50% de atividade enzimática residual. A invertase demonstrou termoresistência em temperaturas de 60 a 70ºC não atingindo o tempo de meia vida em 240 minutos. Nas temperaturas de 75 a 80ºC foram mantidas aproximadamente 40% da atividade residual após 4 horas de incubação. A invertase parcialmente purificada não demonstrou a necessidade de íons metálicos para a ativação catalítica, mas a presença de íons Al3+ e Cu+ provocaram aumento da atividade, enquanto que Sn2+ diminuiu a atividade catalítica. O conteúdo de carboidratos corresponde a 36,57% da massa total de proteína. A invertase do A. casiellus demonstrou ser especificidade à sacarose. Para a purificação da invertase de Aspergillus casiellus, induzido por farelo de soja, foram necessários 2 passos constituídos de colunas cromatográficas de troca-iônica DEAE-Celulose, o que torna o processo viável e com tempo despendido em relação a outros processos. O uso de resíduo agroindustrial para obtenção da invertase torna-se uma ferramenta para o desenvolvimento de tecnologias limpas, convertendo o resíduo em questão em um produto de maior valor agregado.
Abstract: The invertase, enzyme found in yeast, above all in the Sacharomyces cerevisiae species, invertebrate, vertebrate, green alga, bacteries, vegetal and fungus, is one of the principal accountable for sucrose hydrolysis to form the inverted syrup, is used by the food industry and pharmacy, in the hydrolyses of rafinose, inulin and gentianose. In the present work, the invertase was produced by Aspergillus casiellus through solid state fermentation, using the industrial waste of soy bran, during a period of 72 h at 25ºC. The enzyme extraction was done by shaking at 120 rpm to period of 1h. The extract obtained was filtered and stocked in freezer. The enzyme recovery was done throughout the protein precipitation with organic solvents, ammonium sulphate and thermal shock. The invertase purification was carried-out in anion-exchange chromatography DEAE-cellulose. It was characterized the enzyme activity of fermented material, the stability relationship to temperature and pH, optimum temperature and pH, effect of the presence of some ions, chelating, redutors agents and detergents, beyond the neutral carbohydrate content determination and specificity to the substrate. The specific enzyme activity was 1029,75 U/mg after the period of 72h of fermentation using soybean bran as substrate. The precipitation with ammonium sulphate and solvents was less efficient than thermal shock for the invertase recovery. The enzyme was purified through thermal shock and anion-exchange chromatography in DEAE-cellulose with a purification factor of 30,30 fold and a yield of 42,70%. The electrophoretic analyses demonstrated that the studied invertase presents molar mass around 25.5 kDa. After submitted to the purification steps, the enzyme showed optimum pH 4.0 and temperature 70ºC. In relation to the stability, after 24 hours of incubation at pH 4.0, the invertase maintained 50% of residual activity. The invertase showed thermalstability at 60 70ºC not arrive the half-life time in 240 minutes was observed 40% of the catalytic capacity remained. In temperatures of 75-85ºC, 40% of residual activity were maintained after 4h of incubation. The partially purified invertase didn´t need metallic ions for catalytic activity, but the presence of Al3+ and Cu+ improved the activity, and Sn2+ challenged decrease in the activity. Sugar content corresponded to 36.57% of total mass protein. The invertase of A. casiellus demonstrated specificity to sucrose. For purification of the invertase of Aspergillus casiellus, induced through soybean bran, were needed 2 steps made up anion-exchange chromatography DEAE-cellulose, which turn the process practible and with few time despended relationship to the others process. The use of agroindustrial waste to obtain invertase is becoming an instrument to development of clean technology, converting the waste in a valuable product.
Keywords: Invertase
Farelo de soja
Aspergillus casiellus
Fermentação em estado sólido
Caracterização bioquímica
Purificação
Invertase
Soy bran
Aspergillus casiellus
Solid state cultivation
Biochemical charecterization
Purification
Biotecnologia
Fungos
Processos químicos e bioquimicos
CNPq areas: CNPQ::ENGENHARIAS::ENGENHARIA QUIMICA
Idioma: por
País: BR
Publisher: Universidade Estadual do Oeste do Parana
Sigla da instituição: UNIOESTE
Departamento: Desenvolvimento de Processos
Program: Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Engenharia Química
Citation: NOVAKI, Lexandra. Production, purification and partial characterization of invertase obtained from solid state cultivation of Aspergillus casiellus on soybean substrate. 2009. 71 f. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento de Processos) - Universidade Estadual do Oeste do Parana, Toledo, 2009.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://tede.unioeste.br:8080/tede/handle/tede/1883
Issue Date: 16-Mar-2009
Appears in Collections:Mestrado em Engenharia Química (TOL)

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